Nagu pea iga ajastu laps tahtis Betzig noorena astronaudiks saada. Ent 1980. aastateks oli kosmoseajastu kuldaeg juba möödas ja ta pidi leidma doktorantuuri ajaks midagi muud paeluvat. Lõpuks sattus ta Cornelli ülikoolis kokku Aaron Lewisi ja Michael Isaacsoniga, kes otsisid võimalusi uurida rakke, mis olid liiga väikesed, et neid oleks saanud toonaste mikroskoopidega üleüldse märgata. Toona paistis difraktsioonipiir, mis takistas kasutatava valguse lainepikkusest kaks korda väiksemate struktuuride eristamist, veel suuresti läbistamatu müürina.

„Minu juhendajatel oli idee kõrge lahutusvõimega mikroskoobi jaoks, mis hõlmas uuritava pinna lähedale väikese augu panemist, selle kaudu korraga ainult valguse lainepikkusest väiksema ala valgustamist ning selle ringi liigutamist,“ ütles Betzig intervjuus ERR-i teadusportaalile. 1986. aastaks suutis ta Lewisi ja Isaacsoniga eristada juba struktuure, mille läbimõõt oli 50 nanomeetrist väiksem. Tehnika näis muutuvat selle täiustamisel üha paremaks. Betzig tegi aga mõned aastad hiljem kannapöörde ja otsustas akadeemilise maailma selja taha jätta.

Näited uue mikroskoobi poolt pakutavatest võimalustest. Betzig Lab/HHMI

1990. aastatel näis Teie karjäär olevat igati edukas ja Teie saavutused oleksid taganud stabiilse töökoha aastateks. Mis Teid ometi akadeemilistest ringkondadest toona lahkuma sundis?
Mind saatis skaneeriva optilise lähivälja mikroskoopia vallas 1990. aastatel tõepoolest mitmeid kordi edu, kui ma kasutasin seda esimest korda rakkude ülikõrge lahutusvõimega uurimiseks, esimese üksiku molekuli täheldamiseks ja selle toatemperatuuril registreerimiseks. Ühel hetkel püstitasime me tehnika abil ka maailma rekordi andmete talletamise tiheduses jne... Ent ma muutusin 1993-1994. aastal valulikult teadlikuks, et tehnoloogial on selged piirangud.

Peamine põhjus oli tehniline – auk pidi olema uuritavale näidisele äärmiselt lähedal ja uuritav näidis seeläbi ka lame. Isegi siis said sa näha ainult pinna lähedal toimuvat. See oli äärmiselt piirav, muidugi oli teisi probleeme ka. Ma olin natukene pettunud, sest see oli tehnoloogia, mille kallal olin ma töötanud tosin aastat. Kuigi ma arvasin, et sellest saab midagi revolutsioonilist, tuli välja, et see on pelgalt evolutsiooniline. Tänapäeval on sellel mõningad kasutusalad materjaliteaduses ja ränitööstuses, kuid bioloogia jaoks on see pea täiesti kasutu.

Samal ajal hakkasid meie edulugude tõttu lähivälja mikroskoopiaga tegelema tosinad, kui mitte sajad töörühmad. Ja nagu tavaks, kui inimesed tähelepanu ja rahastuse nimel rabelevad, hakkavad nad tehnoloogia poolt potentsiaalselt pakutavate võimaluste osas liialdama. See kõik toimus samal ajal, kui mina selle piirangute tõttu piinlesin.

Ühelt hetkel tundsin ma, et iga minu iga hea tulemus võimaldas teha väga palju halba teadust ja muutis seda tõsiseltvõetavamaks. Ma tundsin tõesti, et minu tegevusel on ühiskonnale pigem negatiivne kui positiivne mõju. Neil põhjustel ütlesin ma endale: „Noh, see pole minu jaoks ja akadeemiline teadus pole minu jaoks. Ma ei usu tõesti kogu selle süsteemi olemusse ega sellesse, kuidas asju tehakse“.

Kõike eeltoodut arvestades võiks imestada, mis Teid ometi teadusesse tagasi tõi...
Järjekordne läbikukkumine, otseloomulikult. Ma lõpetasin oma isa masinaosade valmistamisega tegelevas ettevõttes, kus töötasin välja paar uut tehnoloogiat. Esiteks masinaosade inspektsioonisüsteemi, mis uuris treipinkidelt tulevaid osasid väga kvaliteetselt kõrge lahutusvõime all iga 20 sekundi tagant 24 tundi päevas. See kukkus turul haledalt läbi, kuna ütles põhimõtteliselt firmadele, et peaaegu kõik nende masinate alt tulevad osad polnud tegelikult üldse head. Nad ei tahtnud seda kuulda.

Teine hõlmas hüdraulikasüsteemi, mis võimaldas liigutada väga suuri masse väga täpselt väga suurtel kiirustel. Näiteks oli mul võimalik nihutada nelja tonni suurust raskust kaheksakordse gravitatsioonikiirendusega ja paigutada seda soovitud paika viie mikroni täpsusega. Ent turu vajaduste jaoks oli see liiga eriskummaline ja kõrgtehnoloogiline, mistõttu ei tahtnud keegi selle kasutamise või edasi arendamisega riskida.

Lõpuks, mul on inimeste suhtes, kes suudavad kasumit teenida, väga suur austus. See pole kerge ja sul on tunduvalt rohkem piiranguid, kui laboris töötades ning lihtsalt oma uudishimu järgides. Kuigi mulle ei meeldinud akadeemiline teadus, igatsesin ma võimalust järgida oma uudishimu, loovust. Mängida ja tegeleda R&D asemel lihtsalt R-iga.

Ma hakkasin vaikselt ringi vaatama. Mikroskoopiaga ei tahtnud ma enam tegeleda. Aastatel 1995-2003 ignoreerisin ma teaduskirjandust täielikult. Nii sain ma 2003. aastal teada rohelistest fluorestseeruvastest proteiinidest, mis avastati vahetult pärast seda, kui ma teaduse hülgasin. Ma mõistsin, et see viib mikroskoopias revolutsioonini ja mõtlesin: „Oh pagan, ma pean siiski taas sellega tegelema hakkama!“

PALM mikroskoopia võimaldas uurida kõrge lahutusvõime all näiteks vähirakkude tuuma. Wikimedia Commons

USA rahvusliku tervisearengu ja lastetervise instituudis töötava Jennifer Lippincott-Schwartzi eelnevalt saadud energia mõjul valgust kiirgavad valgud kujutasid endas puuduvat lüli Betzigi aastate vanuse idee realiseerimiseks. Tavalise fluorestsentsmikroskoopia korral sõltub nähtava kujutise kontrastsus peamisele sellest, kui tihedalt suudetakse uuritavasse näidisesse lisatavaid fluorofoore kokku koondada. Lahutusvõime aga difraktsioonipiirist, mis jääb tehnika puhul 150 nanomeetri lähedale.

Piirist saab mööda hiilida, kui vaatleja suudab eristada erinevatelt valkudelt lähtuvaid valgusosakesi. Lippincott-Scwartzi valkudel pole esialgu fluorestseeruvaid omadusi. Ent valke saab aktiveerida neid kindla lainepikkusega valguse valgustades ja seejärel teise kindla lainepikkusega valguslainetega valgust kiirgama panna. Seda pikemat aega tehes hävivad valgud pöördumatult. Betzig mõistis koos tema kunagise Belli Laboratooriumi kolleegi Karl Hessiga, et kui kasutada esmalt väikest arvu valgusosakesi, aktiveerub ja hävib seejärel vaid osa valkudest.

Seda saab teha uuesti ja uuesti. Taoliselt iga kord ainult väikese arvu helenduvate valkude asukohta määrates saab eristada üksikuid fluorofoore, mis viibki difraktsioonipiiri murdmiseni. Registreeritavate valgusosakeste päritolu täpseks määramiseks kasutas veidi teistsugust lahendust samuti sellel aastal Nobeli preemia pälvinud William Moerner, kes suutis muu hulgas 1989. aastal esimese inimesena registreerida vaid ühelt fluorestseeruvalt valgult pärinevat valgust.

Nii asusidki Hess ja Betzig ehitama üheksa aasta eest esimest eelnevalt kirjeldatud põhimõtte alusel töötavat PALM mikroskoopi. Suuruselt tugitooliga võrreldava mikroskoop läks kokku maksma umbes 25 000 dollarit ja mehed kasutasid selle konstureerimisel Hessi vana labori sisseseadet.

PALMi aluspõhimõtteid demonstreerivat mikroskoopi ei konstrueeritud küll garaažis, ent siiski Teie sõbra elutoas. Kas see näitlikustab, et ajad, kus inimesed said revolutsioonilisi tehnoloogiaid laborist väljaspool luua, pole kaugelt möödas?
Tõepoolest, see häirib mind väga, kui ma kuulen, et kõik peab olema seotud suurte töörühmade ja interdistsiplinaarsusega. Et vendade Wrightide või Steve Jobsi ja Wozniaki ajad, kus garaažis igaüks nokitseda sai, on möödanik. Ma arvan, et see on täielikult vale. Tegelikult usun isegi, et ma poleks teadlasena edukas ja mul poleks täna Nobeli auhinda, kui ma peaksin töötama viisil, nagu mu enamik kolleege standardses akadeemilises keskkonnas seda tegema peavad.

Ma usun tõesti, et standardne akadeemia mudel on erakordselt ebatõhus. Sa võtad kellegi, kes on end mähkemetest järeldoktorini üles töötanud ja treenid neid väga edukaks eksperimentaalteadlaseks. Kuid siis järsku heast peast rebid nad selle kõige küljest lahti, tõukad kusagile kontorisse, teed nad administraatoriks ja paned grantide eest võitlema, õpetama, komiteedes istuma jne... Mõnedel on selle järgi isu, ent teistel mitte. Edukad teadlased, kes sattusid sellesse olukorda, kuna nad oli suurepärased eksperimentaatorid, pole seda enam mitte.

Ma arvan, et mul on nii Belli Laboratooriumites, oma isa ettevõttes ja Janeilias töötades väga vedanud, kuna ma olen suutnud leida inimesi, kes on nõus minu tööd rahastama ja lasevad mul kogu aeg laboratooriumis olla. See tähendab, et kuigi ma pole 50ndates eluaastates laboris enam kõige kiirem, on mul väga palju kogemusi.

Ma võrdlen seda pankade liitintressiga. Kui ma saan igal aastal kümne protsendi võrra rohkem kogemusi kui minu konkurendid, siis iga seitsme aastaga on mul neist kaks korda kogemusi. Pane see paari mõne järeldoktoriga, kellel on tohutult indu. Kui nad probleemi otsa satuvad, siis on see tõenäoliselt midagi, mida ma olen 6-7 korda varem näinud ja nad saan kohe õigele teele juhatada. Julgeksin isegi arvata, et see annab meile teise ees Janeilias ebaausa eelise, kuna see võimaldab meil väga kiiresti edasi liikuda.
***
Nobeli preemia võitmine tuli Betzigi väikese üllatusena. Mees pole sisuliselt eelmise põlvkonna mikroskoopide lahutusvõimet 10-20 korda ületava PALM tehnikaga juba kuus aastat üldse tegelenud. Sarnaselt skaneerivale optilise lähivälja mikroskoopiale tundis Betzig ühel hetkel, et sellel on omad puudused, mida on lahutusvõime revolutsioonilisel määral parandamiseks raske kõrvaldada.

„Ülikõrge lahutusvõimega töötamine jäi äärmiselt raskeks, kuna see sõltus pigem sellest, kui hästi uuritavaid näidiseid ette valmistati, mitte selleks kasutatavast katseaparatuurist. Seega nõuab see kasutajast palju rohkem kui füüsikust, kes peab hoolitsema, et mikroskoop korralikult toimib,“ nentis Betzig. Idee uue tehnika loomiseks sündis tegelikult juba ajal, kui ta mõtiskles koos Hessiga, kuidas akadeemilises maailmas taas läbi lüüa ja toetub suuresti Betzigi töörühma poolt loodud Besseli kimbuga valguslehtmikroskoopiale.

Besseli kimp meenutab noolemärklauda. Wikimedia Commons

Besseli kimp tähendab füüsikute žargoonis kiirt, mis ei murdu ja mille jämedus ei sõltu selle pikkusest. Kui Kuu suunas tavaline laser sihtida, võib oodata, et terve kaaslane paistab selle tõttu kergelt punakana ja osa valgusosakesi kalduks sihist isegi nii palju kõrvale, et need asuksid teele ilmaruumi kaugustesse. Välimuselt noolemärklauda meenutavate Besseli kimbuga seda aga ei juhtu. Kuigi keskset kiirt ümbritsevad valgusrõngad hakkavad hajuma, püsib keskne kimp fookuses terves oma ulatuses.

Vähemalt ideaalse Besseli kimbu puhul, mille tekitamiseks kuluks muidugi ka lõpmatul hulgal energiat. Kui tavapärasteks rakendusteks, näiteks triipkoodi lugemiseks, piisab ka vähemast. Betzig otsustas kolleegidega kasutada seda tillukeste rakkude uurimiseks, valgustades neid valguslehekesega külje pealt, mitte risti. Mida suurema energiaga uuritavat näidist korraga küllastada, seda kiiremini see hävib. Näidist paralleelselt valgustades on aga enamik energiat koondunud selle ossa, mida parasjagu uuritakse. Lahendus pärineb sajandi tagusest ajast.

Besseli keskset kiirt ümbritsevad hajuvad rõngad kujutasid aga endiselt probleemi. Lahenduseks oli kaks trikki. Ajaliselt struktureeritud valgustamine ja kahefootoniline mikroskoopia. Esimene hõlmab laseri kuulipildujana ülikiiresti sisse ja välja lülitamist. Viimase mõjul tekivad perioodilised ergastusvõred, mida saab kasutada ebasoovitava valguse kõrvaldamiseks. Kahefootoniline mikroskoopia hõlmas aga fluorofoori kahe valgusosakese abil särama panemist, mis vähendas taustamüra. Taoliselt saadud valguslehed olid aga Betzigi maitse jaoks endiselt liiga paksud.

Võib öelda, et hakkasite uue meetodi kallal töötama 2008. aastal, mis sillutas 2011. aastal ajakirjas ilmunud uurimusele, mis on vastilmunud tööle suhteliselt sarnane. Milliseid fundamentaalseid erinevusi uues töös peale Besseli kimbu jagamise veel leidub?
Besseli kimp on vaid ühte tüüpi murdumatu kiir, teine mittemurduv struktuur on kahemõõtmeline optiline võre. Põhjus, miks me seda võreks kutsume, on veidi kummaline. Me hakkasime esmalt valgusmürgituse vähendamiseks kasutama korraga mitmeid Besseli kimpe. Seejärel otsisime me juba võimalusi, kuidas tekitada samal ajahetkel massiivne rivi paralleelseid kiiri. Seda mudeldades märkasime, et regulaarsete intervallide saab Besseli kimbu kõrvalrõngaid interferentsi abil hävitada ja nõnda palju puhtama valguslehe saada

Siis mõistsin ma, et neid näliselt maagilisi perioode saab minu enda poolt enne PALM mikroskoobi ehitamist loodud teooria alusel ette ennustada. Tuleb välja, et mitmete Besseli kimpu koherentsusmustrid, mis kõige paremini töötavad, ongi kahemõõtmelised optilised võred. Tegelikult on optilisi võresid veelgi, Besseli kimpude rivid on vaid üks optiliste võrede alamjaotus, mida uue tehnika puhul kasutatakse. Ajaks, mil ma seoseid mõistsin, sain oma vana teooria tolmust puhtaks pühkida ja ennustada, millised mustrid võremikroskoobi puhul kõige paremini töötavad.

Hela-60 vähirakk kollageeni maatriksis liikumas. Betzig Lab/HHMI

Uus meetod võimaldab teha sekundis kuni tuhat ülesvõtet, 2011. aastal esitletud mikroskoop umbes 200. Millistele kompromissidele üksikute ülesvõtete lahutusvõime ja neid lahutavate ajavahemike suhtes minna tuleb?
Uue mikroskoobiga saab töötada kahel moel. Nn virvmeetodi (dithered mode) puhul võtame me valguslehe, millel on tavaliselt oma kindel struktuur ja liigutame seda lihtsalt väga kiiresti edasi-tagasi. Nii saame me teha sekundis tuhat pilti. Teise meetodi puhul kasutame me seda perioodilist struktuuri aga enda huvides struktureeritud valgusmikroskoopiast tuntud meetoditega, et ülesvõtete lahutusvõimet tõsta.

Sellel on aga omad puudused. Pildistatava tasandi kohta vajaliku informatsiooni saamiseks tuleb liigutada struktuuriga valguslehti viie väikese sammu haaval. Virvmeetodi puhul piisab igast tasandist ülesvõtte tegemiseks vaid ühes fotost. Ülikõrge lahutusvõimega foto tegemine on 7,5 korda aeglasem (133 kaadrit sekundis), kuid see pakub sulle 40 protsenti paremat resolutsiooni. Sa võid töötada mõlemat moodi.

Kuigi tegelikult on nii, et umbes 30st bioloogide rühmast, kes uut mikroskoopi katsetama tulid, keskendusid enamik 90 protsenti ajast pigem kiirusele kui resolutsioonile. See on kerge pettumus inimesele, kes on üritanud kogu oma karjääri vältel mikroskoopide lahutusvõimet kasvatada.

Sarnaselt eelnevatele aastatele tegite pärast prototüübi loomist tihedalt koostööd teadlastega, kes kasutavad ülikõrget lahutusvõimet oma igapäevases töös. Kas ütleksite, et see on uute meetodite loomisel hädavajalik ja mida insenerid üldse bioloogidelt õppida saavad?
Ma arvan, et see on tegelikult üks mu töörühma tugevusi. Kui vaadata ükskõik millise optika ajakirja numbrit, võid leida biomeditsiinis kasutatavate mikroskoopide ja kuvameetodite kohta tosinaid uurimusi. Ent enamik neist on minu arvates bioloogide tegelikest vajadustest küllaltki kaugel. Nii omistan ma meie edu suuresti võimele mitmete bioloogidega koostööd teha ja neid kuulata. Mõista, mis on nende jaoks tähtis, lasta neil asju proovida ja läbi kukkuda, mis annab meile aimu, mida me tegema peame.

Probleemi olemuse mõistmine on lahenduse leidmisel juba pool võitu. Sa saad neist probleemidest teada aga ainult siis, kui sa töötad bioloogidega. Ja see on kriitiline. Üks minu uurimisasutuse võludest ongi see, et mind ei ümbritse mitte ainult minu enda asutuse eluteadlased, vaid teistest ülikoolidest ja teaduskeskustest pärinevad inimesed. See on meie salarelv.

Äädikakärbse embrüo seljaosa ümbritsev epiteelkude ja amnioserosa.

Olete märkinud, et lahenduse kommertsialiseerimine on hädavajalik samm kindlustamaks, et uus tehnoloogia kogukonnas kanda kinnitab. Samas jagate oma jooniseid ka vabalt. Kas ei tekita teatavaid vastuolusid ja kui lihtsalt mikroskoope teistes laborites üles seada saab?
Tegelikult oli see üks minu peamisi muresid. Belli Laboratooriumites töötades puutusin ma kokku mitmete hämmastavalt imeliste tehnoloogiatega, millest ei õnnestunud Bellil kunagi kasu lõigata ja täiustada. Tavaliselt juhtus see väljaspool laborit, kus inimesed olid võimelised neid kommertsialiseerima või need praktilistelt rakendatavaks muuta. Ma tahtsin probleemi minimaliseerida võimalikult paljude tehnoloogiate puhul, mida me välja arendame.

Me võtsime mikroskoopide puhul kasutusele kolmesammulise lahenduse. Esiteks ei taha inimesed neid tingimata osta või ehitada, kui nad ei tea, et see neid painava probleemi puhul aitab. Nõnda rajasime me Janelias arenenud kuvatehnoloogiate keskuse, kuhu saavad teadlased tulla, mikroskoope proovida ja veeta andmeid kogudes nädal või paar. Siis saavad nad kaaluda, kas nad tahavad seda enda laboris ehitada või oodata, kuni see turul vabalt saadaval on.

Järgmine samm on oma mikroskoobi ehitamine. Me oleme protsessi väga detailselt dokumenteerinud. See sisaldab nii märkmeid, ehitus- ja kalibreerimisinstruktsioone, selleks kasutatavaid materjale jne. Ent see tähendab siiski, et uurimisrühma peaks kuuluma mõni füüsik või insener, kes seda materjali kasutada oskab. Tavaline bioloogide rühm sellega tavaliselt hakkama ei saa. Hetkel oleme me väljastatud 30-40 ehitamislitsentsi. Tänaseks on töökorras umbes viis mikroskoopi.

Lahenduse nii vabalt kui kommertskanalite kaudu jagamisel ei ole tegelikult erilist konflikti. N-ö kodus ehitajate turg on alati olemas, kuid see ei ole võimeline rahuldama väga paljude bioloogide vajadusi. Ainus võimalus selle tegemiseks on anda ettevõtetele võimalus lahendust täiustada ja lihvida, et seda oleks võimalik odavalt turult töövalmina hankida. Seadmel ei ole enne laialdast mõju, kui inimesed ei saa raha kõrvale panna, seda vabalt osta ja sellega kohe tööd tegema hakata. Ettevõtetel on võimalus pakkuda tugistruktuuri, mida masinat iseseisvalt ehitav inimene kunagi teha ei saa.

Ümarussi embrüo lihaste ülikiire kokku tõmbumine ja lõdvestumine. Mõõtskaala 10 mikromeetrit. Betzig Lab/HHMI

Ja viimaks palju kardetud igav, ootuspärane ja ebaoriginaalne küsimus. Mida Te tahaksite oma südametunnistuselt nüüd, pärast Nobeli preemia pälvimist, ära saada?
Ma arvan, et ma võiksin mustast pesust nimekirja teha, kuid üks asi on selle küsimusega otseselt seotud. Omistatud au tundub endiselt ebareaalne, kuna inimesed kohtlevad sind nüüd erinevalt ja küsivad analoogseid küsimusi. Justnagu oleks ma pärast 8. oktoobrit kuidagi targem. Kuid ei, ma olen täpselt sama tüüp ja mul on samad eelarvamused. Kui minu arvamus luges enne 8. oktoobrit, siis võiksid sa mind kuulata, kui mitte, siis unusta see kõik ära.

Teine asi on see, et ma tunnen ennast selle auhinna vastu võtmise pärast kergelt silmakirjalikuna. Kui komitee helistas, siis olin ma kohe nõus seda vastu võtma. Kuid enne seda, kui ma mõtisklesin, mida ma teen, kui ma kunagi Nobeli auhinna peaksin saama, polnud ma selles nii kindel. Ma mõtlesin, et võibolla keeldun ma seda vastu võtmast. Mingi südametunnistuse hääl ütles aga, et „sa ei taha seda teha, kuna see muudaks su veel (halvas mõttes) kuulsamaks, kui seda vastu võttes. Lisaks valmistaks see teatavat pettumust sadadele inimestele, kes seisid sinu edu taga.“ Ma ei tahtnud sadadele inimestele pettumust valmistada, kes olid tehnika loomise juures asendamatud.

Kuid üldisemalt, saavutused on objektiivsed, autasud ja tunnustused aga subjektiivsed. Neid otsuseid teevad vaid paar inimest ja nad ei ole ilmeksimatud. Nii leidub alati vastuolusid, et kes preemia saama peaks ja keda võib ilma jätta. Ma olen tihti teisel pool poodiumit tundnud, et see on autasust ilma jäänud inimeste egodele ja motivatsioonile suurem löök, kui selle vaese tõpra poolt nauditav kasu, kes viimaks selle autasu saab. Kui ma oleks universumi kuningas, siis kaotaks ma tõenäoliselt selle Nobeli jama täielikult ära, kuna ei loe mitte auhinnad, vaid tulemused.

Idee peale tulemine, teadmine, et sul on hea idee, kui see su alateadvust välja hüppab, see on lihtsalt võrratu tunne. Ja siis, kui sa lõpuks laborisse jõuad ja näed, et see tegelikult töötab ja on reaalne, see on parem kui seks! See moment, kui sa näed, et su idee töötab, jääb sinuga igavesti, nagu hetk, kui sa näed esimest korda oma last. Pole mingit autasu, raha ega tunnustust, mis sellega konkureerida suudaks. Ja ma soovin, et inimesed mõtleksid sellises kontekstis, mitte autasude ja tunnustuste raamides.

Betzigi uurimus ilmus ajakirjas Science.